Медицина / Диагностика / Диагностика (статья)

Анализ на фенилпируват при алкогольной болезни печени

АлкоголизмАлкоголизм является одной из актуальных социальных проблем. Вопросам эндокринно-метаболических нарушений (в том числе и патологиям печени), алкогольной зависимости и генетической предрасположенности было посвящено много исследований.

Отдельное внимание специалисты уделяют изучению патогенеза печеночной энцефалопатии, обусловленной алкоголизмом и другими патологиями, механизм развития которой до сих пор полностью не изучен. Однако большинство ученых считают, что основной причиной развития печеночной энцефалопатии является нарушение баланса азота и ароматических кислот. Степень проявления симптомов печеночной энцефалопатии (нервно-мышечные нарушения, поведенческие расстройства, нарушения сознания и др) зависит от нарушений метаболизма в печени. Именно нарушения обменных процессов в печени индуцируют развитие печеночной энцефалопатии, причем не только при алкогольной болезни печени (см статью «Алкогольная Болезнь Печени: Диагностика и Лечение»), но и при других гепатитах.

К основным биохимическим нарушениям, обуславливающих алкогольную болезнь печени, относятся нарушения процессов ферментативного синтеза и биоэнергетических механизмов. В связи с этим, при алкоголизме особое внимание уделяется исследованиям аминокислотного обмена. В первую очередь – нарушениям обмена ароматических аминокислот, а именно:

• Фенилаланин (α-амино-β-фенилпропионовая кислота, сокр.: Фен, Phe, F)
• Тирозин (α-амино-β-(п-гидроксифенил)пропионовая кислота, сокр.: Тир, Tyr, Y)
• Триптофан (β-(β-индолил)-α-аминопропионовая кислота, сокр.: Три, Трп, Trp, W)

Нарушения метаболизма этих трех аминокислот способны вызвать дисбаланс нейромедиаторов (нейротрансмиттеров) центральной нервной системы (адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин), в результате чего при печеночной энцефалопатии возникают разнообразные психоневрологические симптомы.

Физиологический метаболизм фенилаланина включает этапы гидроксилирования (окисления) бензольного кольца фенилаланина с образованием тирозина (образование тирозина в печени обеспечивается поликомпонентой фенилаланингидроксилазной системой, основным компонентом которой является фермент КФ 1.14.3.1 – фенилаланингидроксилаза). Еще один, минорный путь метаболизма фенилаланина в норме преобразует небольшое количество аминокислоты. Попадая в мозг, печень и почки фенилаланин вступает в реакцию переаминирования с альфа-кетоглутаровой кислотой, в результате образуется фенилпируват (фенилпировиноградная кислота), следующим этапом преобразования которого является фенилуксусная кислота (α-толуиловая кислота). Также в результате реакции декарбоксилирования из фенилаланина образуется фенилэтиламин (2-фенилэтиламин, фенэтиламин, β-фенилэтиламин, 1-амино-2-фенил-этан). Отметим, что фенилкетонурия и другие гиперфенилаланинемии, обусловленные мутациями генов, которые отвечают за свойства и синтез некоторых компонентов фенилаланингидроксилазной системы, метаболизм фенилаланина происходит по так называемому «мирному» пути. В результате в организме больного накапливаются фенилаланин и его патологические дериваты (фенилпировиноградная кислота и др) – аллостерические ингибиторы ферментов, которые задействованы в метаболизме тирозина, триптофана и глютаминовой кислоты.

Таким образом, основной причиной развития печеночной энцефалопатии является нарушение активности указанных ферментов, что вызывает нарушение метаболизма тирозина, триптофана и других аминокислот.

Чрезмерное (патологическое) накопление фенилаланина, фенилпировиноградной кислоты и других метаболитов при нарушении преобразования фенилаланина в тирозин, вызывает непосредственное токсическое действие на метаболизм всего организма, особенно на обменные процессы в клетках центральной нервной системы.

Фенилпировиноградная кислота в моче здорового человека отсутствует. Ее появление в моче обусловлено значительным нарушением метаболизма фенилаланина, то есть, нарушением функции фенилаланингидроксилазной системы. Таким образом анализ мочи на наличие фенилпировиноградной кислоты является важным диагностическим исследованием при алкоголизме и патологиях, сопровождающихся нарушениями метаболизма фенилаланина, которые обусловлены экзогенным поражением печени и/или наследственными факторами.

Лабораторный анализ на определение фенилпировиноградной кислоты в моче может быть качественный и количественных. Качественный анализ (например, реакция Феллинга с использованием 10% трехвалентного хлорида железа [FeCl₃]) позволяет выявить нарушение обмена фенилаланила, однако не позволяет получить объективные данные о степени нарушения метаболизма и не определяет количество фенилпировиноградной кислоты. Количественный анализ при гиперфенилаланинемиях разного генеза позволяет определить степень нарушения метаболизма фенилаланина (например, с целью мониторинга лечения – до и после терапии). Кроме этого, показатель количественного анализа на фенилпирувата в моче является одним из важных критериев степени тяжести вирусных гепатитов (см статью «Диагностика и профилактика вирусных гепатитов. Печеночные пробы»).

В настоящее время клиническая лабораторная диагностика не проводит анализ на фенилпировиноградную кислоту в моче у пациентов с алкоголизмом и патологией печени. Существуют аналогичные анализы определения фенилпировиноградной кислоты при алкоголизме, вирусных гепатитах и фенилкетонурии. Скорее всего такая ситуация вызвана отсутствием препаратов фенилпировиноградной кислоты, а количественный анализ требует построения калибровочного графика с использованием в качестве стандарта чистой фенилпировиноградной кислоты.

Тем не менее, учитывая значение количественного анализа на наличие фенилпировиноградной кислоты в повседневной клинической практике, ниже представлен способ получения стандартного препарата фенилпирувата (фенилпировиноградной кислоты) и модифицированный метод ее количественного анализа в моче у пациентов с хроническим алкоголизмом.

Синтез фенилпирувата

Метод синтеза фенилпирувата основан на прописи Herbst и Shemin, проводится в три этапа.

I этап – получение ацетуровой кислоты (ацетамидоуксуоная кислота, ацетилглицин): 75 г глицина растворяют в 300 мл воды, перемешивают до полного растворения глицина. Затем одномоментно добавляют 215 г (2 М) 95% уксусного ангидрида [(CH₃CO)₂O] и энергично перемешивают в течение 15 минут, потом охлаждают до 5°C. Полученный осадок на воронке промывают ледяной водой, затем его сушат в течение 45 минут при температуре 110°C. Выход ацетуровой кислоты – 26 г; с помощью упаривания маточного раствора можно дополнительно получить 3 г менее чистой ацетуровой кислоты. Температура плавления ацетуровой кислоты – 208°C.

II этап – получение α-ацетоаминокоричной кислоты: в коническую 1-литровую колбу последовательно добавляют:

• Ацетуровая кислота – 19,5 г (0,5 M)
• Безводный ацетат натрия (уксуснокислый натрий, CH₃COONa) – 10 г (0,37 М)
• Свежеперегнанный бензальдегид (бензойный альдегид, C₆H₅CHO) – 26,3 г (0,74 М)
• 95% уксусный ангидрид [(CH₃CO)₂O] – 44,7 г (1,25 М)

Полученную смесь полностью растворяют путем нагревания на водяной бане при температуре 60°C в течение 20 минут. Раствор помещают в колбу с обратным холодильником, кипятят в течение 1 часа, затем охлаждают до температуры 4°C. В результате образуется твердая масса кристаллов желтого цвета, которые обрабатывают 125 мл ледяной воды, измельчают, и хорошо промывают холодной водой. Осадок высушивают в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом и КОН. Выход полученного азалактона ацетоаминокоричной кислоты составляет 33 г (температура плавления – 149°C). 23,5 г (0,25 М) азалактона в смеси 225 мл ацетона и 87,5 мл воды растворяют при кипячении в круглодонной колбе с коротким горлом. Завершение омыления проводят путем кипячения смеси с обратным холодильником 3 часа. Потом основное количество ацетона отгоняют на водяной бане. Раствор фильтруют, затем кипятят с 5 г активированного угля в течение 10 минут, потом фильтруют с использованием вакуума при температуре кипения. Активированный уголь в воронке промывают 4 раза кипящей водой порциями по 25 мл, промывные воды добавляют к основному раствору. Раствор охлаждают до температуры 4°C. Образованные бесцветные игольчатые кристаллы извлекают (путем отсасывания), промывают в 100 мл ледяной воды, затем высушивают при температуре 100°C в течение 2 часов. Выход чистой α-ацетоаминокоричной кислоты – 20,5 г; температура плавления – 191°C.

III этап – получение фенилпирувата (фенилпировиноградной кислоты). В 500-милилитровую колбу, с присоединенной на шлифу обратным холодильником, добавляют 20 мл 1 н. НСl и 10 г (0,05 М) α-ацетоаминокоричной кислоты, затем кипятят в течение 3-х часов и охлаждают до температуры 4°C. Образовавшиеся кристаллы на воронке промывают холодной водой, потом сушат в вакуум-эксикаторе над CaCl₂ и КОН. Выход чистого фенилпирувата составляет 7 г; температура плавления – 150°C.

Анализ мочи на фенилпируват по цветной реакции с хлорным железом

Реактивы

• Буферный раствор, pH – 2,2: глицин – 7,5 г; NaCl – 5,85 г; 0,1 н HCl, 400 мл дистиллированной воды до 1 л
• 10% трехвалентного хлорида железа (FeCl₃)
• Раствор фенилпирувата в 96% этаноле (концентрация – 1 мг в 1 мл)

Анализ

В 1 мл мочи, предварительно разведенной с водой в пропорции 1:10, добавляют 5 мл буферного раствора и 0,2 мл 10% раствора FeCl₃. Оптическая плотность измеряется с помощью спектрометра (длина волны 630 нм в кювете с длиной оптического мути 1 см в течение 3 минут) против холостого опыта (вместо мочи применяют 1 мл H₂O).

Калибровочный график строят на основании реакции с растворами, которые содержат от 10 до 600 мкг фенилпирувата в 1 мл. Температура (10-34°C) не влияет на окрашивание в зеленый цвет. Калибровочная кривая имеет линейный характер до Е_630нм = 1,1. В таких условиях можно обнаружить 98,5% фенилпирувата, добавленного в здоровую мочу.

Калибровочный график для определения фенилпирувата в моче
По оси ординат – Е при 630 нм;
По оси абсцисс – концентрация фенилпирувата в мг%

С помощью указанного выше метода исследуют не только фенилпируват, но и концентрацию фенилаланина, а также уровень гомогентизиновой кислоты. Отметим, что суточную порцию мочи невозможно собрать у большинства пациентов и данное исследование проводили на образцах, отобранных из разовых порций.