Медицина / Диагностика / Диагностика (статья)

Цитомегаловирусная инфекция: Лабораторная Диагностика

ЦитомегаловирусЦитомегаловирусная инфекция обусловлена вирусом герпеса V-го типа (Cytomegalovirus, CMV), характеризуется полиморфной клинической симптоматикой и специфической морфологической картиной – наличие цитомегалических клеток (ЦМК) на фоне лимфогистиоцитарных инфильтратов.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) у каждого третьего жителя планеты после 35-летнего возраста обнаруживают антитела к CMV. В разных странах и регионах частота инфицирования CMV может варьироваться в пределах 45-98%. Цитомегаловирусная инфекция особенно распространена в развивающихся странах, а в благополучных странах широкое распространение инфекции отмечается в районах, где проживает население с низким социально-экономическим статусом.

Актуальность проблемы цитомегаловирусной инфекции обусловлена значительным распространением среди новорожденных и детей раннего возраста, смертностью, трудностями интерпретации проявления этой инфекции (особенно в случаях генерализации инфекционного процесса), а также ее влиянием на течение у ВИЧ-инфицированных и при ВИЧ-ассоциированных заболеваниях.

Источником заражения цитомегаловирусной инфекции является человек. CMV выделяют в слюне, моче, крови, грудном молоке, сперме, вагинальном и цервикальном секрете. Так, примерно у 20-30% здоровых беременных в слюне обнаруживают CMV, у 5-20% - в вагинальном секрете или цервикальном канале. У 20-60% серопозетивных женщин CMV обнаруживают в грудном молоке. Частота врожденной цитомегаловирусной инфекции среди всех новорожденных составляет примерно 0,2-1%.

В слаборазвитых странах 10-35% детей инфицируются CMV в возрасте до 1 года. В случае заражения плода на ранних строках беременности возникает риск выкидыша или внутриутробной смерти. При заражении плода на поздних сроках беременности, существует риск врожденных пороков развития; примерно у 10% инфицированных новорожденных отмечается поражение нервной системы (судороги, задержка интеллектуального развития, микроцефалия и др), органов зрения (ретинит), печени и селезенки (тромбоцитопения, желтуха, гепатоспленомегалия).

Отметим, что заражение CMV может произойти при парентеральных манипуляциях или гемотрансфузии. По статистике примерно у 14% пациентов после гемотрансфузии отмечают реактивацию CMV, у 4% со временем возникают клинические проявления инфекции.

Клинически выраженная цитомегаловирусная инфекция является серьезным инфекционным осложнением у больных после трансплантации костного мозга и солидных органов (печени, почек), а также одной из распространенных причин длительной госпитализации больных и их смерти.

Клинически выраженная генерализованная цитомегаловирусная инфекция часто наблюдается в структуре оппортунистических заболеваний у ВИЧ-инфицированных пациентов (отмечается у 10-40% больных СПИДом, которые не получают антиретровирусную терапию, и у 3-7% случаев ВИЧ-инфицированных, поучающих антиретровирусное лечение). Примерно у 40% больных на последней стадии СПИДа цитомегаловирусная инфекция вызывает ретинит поражение сетчатки глаза (обнаруживаются при аппаратной диагностике).

Эпидемиология

Цитомегаловирус (CMV) относится к семейству Herpesviridae (герпесвирусов). CMV повсеместно распространен и заражает практически всех людей. С момента его открытия, эта инфекция признана одной из самых распространенных врожденных вирусных инфекций у людей (ежегодно в США цитомегаловирусная инфекция поражает от 20 000 до 40 000 новорожденных). Нужно отметить, что врожденная цитомегаловирусная инфекция является распространенной причиной негенетической сенсоневральной потери слуха у детей. Кроме этого, CMV является важным фактором заболеваемости и смертности среди лиц с иммунодефицитными состояниями (в первую очередь – больных СПИДом и реципиентов трансплантатов органов и стволовых клеток).

Клиническое значение инвазивного заболевания цитомегаловирусной инфекцией обусловило разработку диагностических процедур, позволяющих быстро идентифицировать лиц с ослабленной иммунной функцией, инфицированных CMV, и новорожденных с врожденной цитомегаловирусной инфекцией.

Исследования, проведенные в Европе, оценивают частоту наличия CMV у 41-56% беременных (показатель инфицирования турецких женщин составляет 98,3%; среди иммигрантов из Пакистана в Норвегии – 100%). Исследования в Японии продемонстрировало инфицированность у 87,3%.

Частота передачи инфекции от матери ребенку зависит от того, была ли материнская инфекция первичной или вторичной. Доказательства низкого уровня свидетельствуют о передачи у 30-50% случаев после первичной инфекции и 0,5-3,0% - после вторичной. Общая распространенность врожденной цитомегаловирусной инфекции при рождении оценивается в 0,62-0,70%.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что цитомегаловирусная инфекция у беременных чаще встречается среди женщин низшего социально-экономического статуса (1,2%), чем среди женщин высшего социально-экономического статуса (0,39%). Доказательства первичного инфицирования (сероконверсия) также более вероятны в группе низшего социально-экономического статуса. Частое и длительное общение с детьми, возрастом до 3 лет (например, родители, опекуны или воспитатели), повышают риск инфицирования, так как CMV в течение длительного времени выделяется детьми этой возрастной группы.

• Положительный анализ на Anti-CMV-IgG свидетельствует об инфицировании, но не позволяет определить сроки инфицирования (это относится к лицам, возрастом старше 12 месяцев, когда в организме перестают циркулировать материнские антитела)
• При диагностике первичной инфекции можно применить определение Anti-CMV-IgG методом анализа парных сывороток, взятых с интервалом 1-3 месяца. Сероконверсия (первый анализ образца на Anti-CMV-IgG – отрицательный, второй – положительный) является надежным доказательством первичной инфекции

Наличие Anti-CMV-IgM нельзя использовать самостоятельно при диагностике первичной цитомегаловирусной инфекции, так как IgM могут определяться и при вторичном инфицировании. Положительные результаты IgM в сочетании и низкими показателями авидности IgG является достоверным свидетельством первичной инфекции, с учетом ограничений исследования авидности (описано ниже).

• Анализ авидности IgG позволяет определить сроки заражения. Антитела IgG, выделенные после первичной цитомегаловирусной инфекции, характеризуются низкой авидностью (то есть, слабую связь «антиген-антитело»). Примерно через 2-4 месяца с момента инфицирования IgG-антитела дозревают – авидность повышается (сильная связь «антиген-антитело»). Таким образом, исследование авидности можно использовать для оценки низкой авидности, что свидетельствует о недавнем инфицировании) против высокой авидности (давнем инфицировании). Отметим, что не все анализы на авидность были проверены, поэтому их интерпретация требует осторожности.

Диагностика CMV у новорожденных

Для диагностики врожденной цитомегаловирусной инфекции стандартным лабораторным анализом является ПЦР (полимеразная цепная реакция) слюны. ПЦР мочи, как правило, назначают для подтверждения диагноза (основной причиной проведения подтверждающего анализа мочи является тот факт, что большинство сероположительных матерей, инфицированных CMV, передают вирус ребенку через грудное молоко, что может быть причиной получения ложноположительного результата анализа на CMV в слюне, образец которой был взят на анализ после кормления малыша.

Сегодня не проводится рутинное исследование новорожденных на предмет инфицирования CMV, но в некоторых странах новорожденным назначают целенаправленную диагностику наличия цитомегаловирусной инфекции.

Риски CMV для беременных

Основными рисками беременности, обусловленными цитомегаловирусной инфекцией, являются:

• Передача инфекции плоду (составляет примерно 40% первичных инфекций у беременных). В случае инфицирования плода возникает риск нарушений внутриутробного развития, в том числе поздний выкидыш, а также отставание в развитии после рождения. Отметим, что около 10% младенцев с врожденной цитомегаловирусной инфекцией рождаются уже с характерными признаками (ограничение роста, аномалии развития головного мозга, нарушения слуха, воспаление сосудистой оболочки и сетчатки глаз) и относятся к группе риска развития неврологических патологий (в том числе двигательный и когнитивный дефицит), нарушения зрения и слуха
• Несмотря на то, что гестационный срок повышает риск передачи инфекции от матери плоду, инфицирование на ранних сроках беременности сопровождается гораздо большим риском появления тяжелых симптомов, чем на поздних

Выводы о значении антенатальной диагностики цитомегаловирусной инфекции ограничены из-за отсутствия доказательств соответствующих сроков исследований, прогноза для инфицированного плода и эффективности лечения, направленного на предупреждение передачи инфекции от матери. Например, в США (CDC 2008), Канаде (Yinon et al 2010) или в Великобритании (NICE 2008) рутинное исследование цитомегаловирусной инфекции у матерей не рекомендовано.

Риски и преимущества диагностики

На сегодняшний день нет доказательств высокого уровня преимуществ и рисков диагностики цитомегаловирусной инфекции. Нарративные рецензии демонстрируют следующее:

Преимущества

• Идентификация женщин с риском первичной инфекции, что предусматривает предоставление профилактических рекомендаций
• Диагностика инфекции во время беременности
• Мониторинг беременности и вариант диагностического тестирования ребенка для женщин с известной инфекции
• Возможность прервать беременность при обнаружении инфицирования плода на начальных сроках беременности
• Раннее начало неонатального антивирусного лечения

Риски и ограничения

• Тревога матери
• Отсутствие доказательств соответствующих сроков исследования (вирус может быть приобретен ребенком и влиять на плод в течение всего срока беременности)
• Потенциальная вероятность получения ложноположительных результатов
• Трудности обнаружения первичного или вторичного инфицирования матери
• Отсутствие эффективной вакцинации или лечения
• Потенциальный вред диагностики (например, риск выкидыша, обусловленный амниоцентезом)
• Отсутствие предполагаемой уверенности в вероятности развития у инфицированного плода выраженных нарушений, обусловленных цитомегаловирусной инфекцией, при рождении

Выводы в отношении экономической эффективности диагностики цитомегаловирусной инфекции ограничены недостаточным количеством доказательств эффективности лечения при профилактике врожденной инфекции.

ЛАБОРАТОРНЫЕ АНАЛИЗЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА

Серологические анализы

Серологическое исследование, основанное на показателях Anti-CMV-IgG (наличие или отсутствие), позволяет определить цитомегаловирусную инфекцию в прошлом. Описано и проведена оценка огромного количества анализов на обнаружение Anti-CMV-IgG: фиксация комплимента, ИФА (иммуноферментный анализ), антикомплементарная иммунофлюоресценция, радиоиммунный анализ, непрямая гемагглютинация и др.

Обнаружение Anti-CMV-IgM указывает на острую инфекцию или недавнее заражение. Для этого исследования применяют много разных методов, но чаще всего – иммуноферментный анализ, основанный на исследовании реакции «антиген-антитело» в необработанных вирусных препаратах. Рекомбинантные анализы IgM с использованием рекомбинантных протеинов и пептидов разработаны с целью стандартизации серологических анализов. Однако исследования показали плохую корреляцию результатов, полученных с разными коммерческими наборами для IgM-теста. Из-за ограничения IgM-тестов в некоторых популяциях используют анализ авидности IgG, что позволяет отличить вторичное инфицирование от первичного (низкая авидность Anti-CMV-IgG наблюдается в первые несколько месяцев с момента инфицирования, со временем авидность повышается, отображая формирование иммунного ответа). То есть, высокий показатель авидности Anti-CMV-IgG свидетельствует о давнем инфицировании. Равные значения показателей авидности обозначаются как «индекс авидности», отображающий процент IgG, связанного с антигеном после обработки денатурирующим веществом.

Культура клеток

Культивирование клеток является традиционным методом обнаружения CMV. Для проведения исследования используют клинические образцы, которые инокулируют на клетки фибробластов человека, инкубируют и наблюдают за ними в течение 2-21 суток. Стандартная техника культивирования позволяет наблюдать типичный цитопатический эффект (дегенеративные изменения клеточных культур), характеризующийся наличием групп плоских, набухших клеток, где типичный цитопатический эффект непосредственно связан с титром CMV. Недостатком этого метода является срок его выполнения – 2-3 недели (до этого момента результат анализа не может быть определен как «отрицательный»).

Центрифугирование образца на клеточный моношар в значительной степени способствует адсорбции вируса и позволяет эффективно повысить инфекционность вирусного инокулята. Вирусные антигены могут быть обнаружены с помощью моноклональных антител, действие которых направлено на вирусный антиген раннего CMV, путем непрямой иммунофлюоресценции через 16 часов инкубации. Этот метод адаптирован для выполнения в 96-луночных микротитровальных планшетах, что дает возможность одновременно исследовать большое количество образцов.

Антигенемия

Антигенемия (antigenemia) используется для количественного определения CMV в образцах крови. Анализ основан на использовании моноклональных антител, которые позволяют обнаружить антиген вирусного pp65, структурного позднего протеина, экспрессирующегося в лейкоцитах крови во время ранней фазы цикла репликации CMV. Антигенемию измеряют количественно путем оценки положительных ядер лейкоцитов в иммунофлюоресцентном анализе фосфопротеина матрицы CMV pp65 на цитоспиновом препарате 2 × 105 лейкоцитов в периферической крови. Этот анализ ограничивается обнаружением вируса в лейкоцитах; демонстрация сигналов положительного окрашивания в ядрах лейкоцитов свидетельствует о положительном результате. Нужно отметить, что этот анализ предоставляет не только качественны, но и количественный результат, который тесно коррелируется с виремией и тяжестью клинического течения в иммуносупрессивных популяциях.

Недостатком антигенемического анализа является трудоемкость с низкой пропускной способностью (на сегодняшний день это исследование нельзя автоматизировать). Также на анализ влияют субъективные предубеждения, зависящие от квалификации специалистов лаборатории, которая необходима для точного выполнения исследований и дальнейшей интерпретации результатов. Полученные образцы биологического материала необходимо быстро обработать (в течение 6 часов), так как задержка значительно влияет на чувствительность анализа (см статью «Специфичность и чувствительность анализа»). Ложноположительные результаты анализа особенно часто встречаются у нейтропеничных больных, так как антигенемическое исследование зависит от наличия достаточно количества полиморфноядерных лейкоцитов.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – доступный, быстрый и чувствительный метод обнаружения CMV, основанный на амплификации нуклеиновых кислот. Методы ПЦР, как правило, ориентированы на большие непосредственные ранние и поздние антигенные гены в их хорошо сохраненных участках, однако ряд других генов используют в качестве мишеней для обнаружения ДНК CMV (ДНК можно получить из цельной крови, лейкоцитов, плазмы, а также из любой другой ткани или жидкости: биоптат, моча, спинномозговая жидкость). Снижение качества образцов биологического материала со временем после забора не представляет особой проблемы для ПЦР-анализа, в отличие от других исследований, направленных на обнаружение CMV.

ПЦР для обнаружения ДНК CMV качественным и количественным (определяется количество ДНК вируса в соответствующем образце). Порог качественного метода нужно тщательно калибровать, чтобы избежать чрезмерного обнаружения. Количественная ПЦР (Real-Time PCR) позволяет проводить беспрерывный мониторинг лиц с нарушением иммунной функции для определения риска развития цитомегаловирусного заболевания, начала превентивного лечения и определения эффективности терапии (ответа на терапию).

В сравнении с анализом антигенемии, ПЦР дорогое исследование, однако оно быстрое и может быть автоматизированным. Результаты анализа ПЦР предоставляются, как правило, в количественном значении – количество копий в 1 мл крови (плазмы).

Обратная транскриптаза (RT-PCR) используется для обнаружения вирусных транскриптов мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота) в лейкоцитах периферической крови, в независимости от наличия ДНК вируса. Отсутствие циркулирующих мРНК связано с отсутствием симптомов, обусловленных цитомегаловирусной инфекцией, независимо от наличия или присутствия ДНК CMV (в таких случаях ДНК CMV определяется только в условиях развития клинической картины). Наличие ранней мРНК CMV продемонстрировано в моноцитах и полиморфоядерных лейкоцитах во время активации цитомегаловирусной инфекции. Это исследование менее чувствительное, чем анализ на антиген pp65 и ПЦР при диагностике патологии CMV.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимическое исследование проводится прежде всего на образцах ткани (биоптата) или жидкостей организма. Образцы для исследования готовят из замороженных срезов биоптата (полученных из легких, печени и др) или путем центрифугирования клеток с дальнейшим их переносом на предметное стекло. На исследуемый образец наносят поликлональные или моноклональные антитела к ранним антигенам CMV и проводят визуализацию флуоресцентно мечеными антителами или мечеными ферментами вторичных антител, которые визуализируются при изменении цвета субстрата. Затем окрашенные слайды исследуют путем световой или флуоресцентной микроскопии. Эта методика обладает лучшей чувствительностью и большей специфичностью в сравнении с простым гистологическим исследованием, однако иммуногистохимическое исследование – очень трудоемкий процесс, который требует хорошей подготовки персонала лаборатории при интерпретации результатов. Отметим, что иммуногистохимия может давать ложноотрицательные результаты, что обусловлено фокальным распределением вируса.

Амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот

Амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA – Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) – исследование, основанное на специфической амплификации (увеличении числа копий ДНК) методом последовательности нуклеиновых цепей неразорванной вирусной мРНК (экспрессия поздней мРНК pp65) на фоне ДНК с использованием специфической изометрической методики амплификации. Исследования показали, что метод амлпификации на основе последовательности нуклеиновых кислот может обладать большей чувствительностью, чем анализ антигенемии для обнаружения цитомегаловирусной инфекции в крови. После забора образцы цельной крови можно хранить до проведения анализа, сам анализ можно завершить через сутки. Несмотря на то, что NASBA является стандартизированным методом диагностики, процедура экстракции мРНК требует много времени.

Источники:

CDC
Bestpractice
National Institute of Health
Australian Government – Department of Health