Медицина / Фармакология / Фармакология (статья)

Влияние консерванта глазных капель бензалкония хлорида на состояние лизосомальных мембран тканей переднего отдела глаза

ОфтальмологияСпециалисты Института глазных болезней и тканевой терапии имени В.П. Филатова, Национальной академии медицинских наук Украины, Львовской областной клинической больницы и Львовского национального медицинского университета имени Д. Галицкого под руководством Т.Б. Гайдамака, В.И. Сенишина и С.Я. Рафалюк провели исследование, целью которого было изучение влияние консерванта глазных капель бензалкония хлорида в различных концентрациях на состояние лизосом тканей переднего отдела глаза.

При применении бензалкония хлорида отмечается значительная лабилизация лизосомальных мембран тканей переднего отдела глаза, наиболее высокая степень которой в роговице и конъюнктиве отмечается при применении 0,1%-го раствора бензалкония хлорида. Активность кислой фосфатазы связанной формы в роговице и конъюнктиве повышается по сравнению с нормой на 25,6% и 30,7% соответственно, а свободной снижается на 26,9% и 31,3% соответственно.

Бензалконий хлорид имеет неоспоримые преимущества в плане своего бактерицидного действия и способности улучшать проникновение действующего лекарства в орган зрения.

Анализ многочисленных клинических наблюдений свидетельствует о выраженных побочных эффектах консервантов при применении различных офтальмологических препаратов, в первую очередь антиглаукоматозных капель. Последние как на основе аналогов простагландинов, так и других гипотензивных средств наиболее часто в качестве консерванта включают антисептик бензалконий хлорид.

В настоящее время бензалконий хлорид является наиболее распространенным консервантом с выраженным бактерицидным действием, используемым в производстве глазных капель. Наряду с бактерицидным действием. Это средство обладает еще одним важным свойством – ослабление межклеточных соединений эпителия роговицы, что способствует улучшенному проникновению лечебного препарата в переднюю камеру глаза.

Однако бензалконий хлорид также обладает и рядом негативных свойств: тенденцией к своей аккумуляции в тканях и негативному воздействию на витальность последних. Отчетливо выраженное токсическое воздействие бензалкония хлорида на ткани переднего отдела с последующим разрушением эпителиальных покровов глаза было установлено рядом экспериментов и клинических наблюдений.

В современной научной литературе приведен целый ряд данных о цитотоксическом действии большинства консервантов, применяемых в системе глазных капель при лечении офтальмологических заболеваний. Наряду с этим существует и реальная необходимость в их использовании в качестве бактерицидных препаратов, пролонгирующих срок сохранности применяемых лекарственных средств. Поэтому сегодня экспериментально-исследовательскими группами решается серьезная задача о нейтрализации или частичном ослаблении токсических свойств консервантов, используемых в производстве лекарств для наружного применения в офтальмологии. Несомненно, это возможно только на основе выяснения особенностей их цитотоксического влияния на ткани глаза.

Так, в ряде работ, посвященных изучению действия бензалкония хлорида, входящего в состав растворов глазных капель в разных концентрациях, была подтверждена цитотоксичность этого вещества, возрастающая при увеличении концентрации последнего.

Согласно экспериментальным исследованиям, степень воздействия бензалконий хлорида на ткани глаз кроликов существенно различалась при различных его концентрациях (0,02%, 0,01% и 0,005%) в растворе глазных капель при закапывании их в глаза животных трижды с интервалом в 5 минут. Сразу же по завершении эксперимента глаза исследовались на конфокальном микроскопе. В результате у первых двух экспериментальных групп животных все клетки роговичного эпителия были видоизменены, а у 3-й группы был выявлен лишь эпителиальный отек.

Ряд экспериментальных работ по тестированию и изучению действия различных медицинских препаратов в виде глазных капель, включающих в свой состав консерванты, проведен с использованием различных аппаратных методик, электронной микроскопии, а также гистохимии и иммунногистохимии. К примеру, было изучено цитотоксическое действие сразу нескольких лекарственных препаратов, содержащих бензалкония хлорид в разных концентрациях, через 30 дней после их инстилляции. Применение биматопроста с 0,005%-м содержанием бензалкония хлорида и аналога простагландина с 0,005%-м бензалкония хлорида оказалось менее токсичным и вызывающим апоптоз для эпителиальных клеток, чем применение тимолола с 0,01 %-м бензалкония хлорида и латанопроста с 0,02%-м бензалкония хлорида.

Проводился также ряд экспериментов по выявлению цитотоксичности бензалкония хлорида на подопытных крысах – использование конфокальной микроскопии подтвердило дозозависимость цитотоксичного эффекта этого консерванта. Так, при концентрациях бензалкония хлорида 0,5% и 0,25% вызывались деэпителизация и выраженные структурные повреждения стромы роговицы. При концентрации бензалкония хлорида 0,1% происходила десквамация эпителиальных клеток с их деструктуризацией. А при концентрации бензалкония хлорида 0,01% повреждался лишь поверхностный эпителиальный слой.

В целом же все вышесказанное обусловливает актуальность углубленных исследований патогенетических механизмов негативного действия консервантов глазных капель на ткани глаза. Особую значимость в этом аспекте представляет мембранотропное действие бензалкония хлорида на такие внутриклеточные органеллы, как лизосомы, т.к. доказана их регуляторная роль в клеточном гомеостазе и развитии апоптоза.

Результаты экспериментов, независимо проведенных учеными мира в разное время, свидетельствуют о том, что наиболее приемлемой концентрацией бензалкония хлорида является ее минимальная величина – 0,01%

Основной целью исследования было изучение влияния консерванта глазных капель бензалкония хлорида в различных концентрациях на состояние лизосом тканей переднего отдела глаза.

Для проведения эксперимента использовали 34 кролика весом 2,2-2,7 кг.

Работа с животными проводилась с учетом требований Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с экспериментальными животными, которые были предложены на Совете международных медицинских организаций «О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием экспериментальных животных» (1985 г.).

Все лабораторные животные были разделены на 3 группы: 1-я группа – контрольная (10 кроликов), 2-я группа – опытная (12 кроликов), животные получали инстилляции 0,02%-го раствора бензалкония хлорида, 3-я группа – опытная (12 кроликов), получавшие 0,1 %-й раствор бензалкония хлорида.

Для инстилляций использовали 0,02%-й и 0,1 %-й растворы бензалкония хлорида, приготовленные на изотоническом фосфатном буфере (pH 7,3-7,4). Животные контрольной группы получали этот же раствор без бензалкония хлорида. Инстилляции проводили ежедневно (2 раза вдень) на протяжении 2 недель.

Для исследования брали ткань роговицы, конъюнктивы и слезную жидкость. Исследуемые ткани немедленно удалялись и помещались в охлажденную свежеприготовленную среду для гомогенизирования. Ткани переднего отдела глаза животного гомогенизировались и суспензировались в буфере, содержащем 20 мМ HEPES-KOH (рН=7,5), 1,5 М MgCl₂, 0,5 М сахарозы, содержащей поливинилпиролидон.

В конце эксперимента все животные были выведены из строя с помощью летальной дозы пентобарбитола натрия (100 мг на 1 кг вводимого в маргинальную ушную вену).

Полученный осадок, содержащий лизосомы, был ресуспензирован и использовался для биохимических анализов – определения активности связанных лизосомальных ферментов. В надосадочной жидкости определяли активность внелизосомальной кислой фосфатазы - фермента, вышедшего из указанных ультраструктур вследствие лабилизации и дезинтеграции их структур. Активность различных форм маркерного лизосомального фермента – кислой фосфатазы в роговице, конъюнктиве и слезной жидкости – определялась с помощью методов спектрофотометрического анализа.

Исследуемые ткани аккуратно гомогенизировалась в стеклянном гомогенизаторе с тифлоновым настилом. Полученный гомогенат центрифугировался при 750 g в течение 10 мин при 4°С для удаления ядер и неразрушенных клеток. Супернатант затем был центрифугирован при 6000 g в течение 15 минут.

Принцип метода определения активности кислой фосфатазы основан на определении концентрации свободного органического компонента субстрата – паранитрофенилфосфата, образующегося в результате действия фермента. Гомогенат готовили в соотношении 1:10 (вес ткани по отношению к объему среды для гомогенизации). Для определения активности кислой фосфатазы в пробирках последовательно смешивали 0,1 мл слезной жидкости или экстракта ткани и 1,0 мл субстратно-буферного раствора (0,127%-й раствор паранитрофенилфосфата в ацетатном буфере, рН=5,0). Пробирки с реакционным раствором инкубировали точно 30 минут при 37,0 ± 0,5°С. Реакцию останавливали добавлением 1,0 мл охлажденного до 0°С 1 Н раствора гидроксида натрия. Измерения оптической плотности исследуемых растворов проводили на спектрофотометре Spekol-210 в односантиметровой кювете при длине волны 410 нм. Рассчитывали активность кислой фосфатазы с использованием молярного коэффициента экстинкции, найденного путем экстраполяции по предварительно построенному калибровочному графику, и выражали в нкат/мл слезной жидкости или нкат/г ткани. Коэффициент вариации данного метода составлял 7,8%.

Полученные данные подвергались статистической обработке с помощью пакета SPSS 11.0.

В тканях роговицы и конъюнктивы определялась активность свободной и связанной формы кислой фосфатазы, в слезной жидкости – только свободная форма кислой фосфатазы.

Полученные в результате исследования данные позволили раскрыть важное звено патогенного действия изучаемого консерванта на ткани глаза. Выявленные биофизические особенности действия бензалкония хлорида необходимо учитывать при оценке физиологического и патологического состояния органа зрения. На основании полученной информации были сделаны следующие выводы:

1. В условиях применения консерванта глазных капель бензалкония хлорида отмечается значительная лабилизация лизосомальных мембран тканей роговицы и конъюнктивы, степень которой зависит от концентрации консерванта в инстилляционном растворе.
2. Наиболее высокая степень дезинтеграции лизосом в роговице и конъюнктиве отмечается при применении 0,1%-го раствора бензалкония хлорида. Активность маркерного лизосомального фермента – кислой фосфатазы неседиментируемой формы в роговице и конъюнктиве повышается по сравнению с нормой на 25,6% и 30,7% соответственно, а седиментируемой снижается на 26,9% и 31,3% соответственно.
3. Значительная степень повреждения лизосомальных структур роговицы при инстилляциях бензалкония хлорида в концентрации 0,02%, применяемой в большинстве глазных капель, обуславливает необходимость поиска способов снижения негативного мембранотропного влияния консерванта на ультраструктуры тканей переднего отдела глаза.